การแบ่งปันบทความ丨AI-CRISPR ที่ปรับปรุงแล้ว-แพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิก Cas14a เพื่อการตรวจหาไวรัสเจมิไนในไซต์ที่แม่นยำ-ในต้นมะเขือเทศและแมลงหวี่ขาว
Apr 09, 2026
ฝากข้อความ
Geminiviruses ก่อให้เกิดภัยคุกคามร้ายแรงต่อการผลิตมะเขือเทศทั่วโลกผ่านการวิวัฒนาการที่รวดเร็วและการแพร่เชื้อโดยแมลงหวี่ขาวทั่วโลก วิธีการตรวจหาในปัจจุบันมุ่งเป้าไปที่พืชที่มีอาการเป็นหลัก โดยมักจะให้ผลการวินิจฉัยหลังจากที่ปริมาณไวรัสถึงระดับที่แพร่เชื้อได้แล้วเท่านั้น ส่งผลให้การควบคุมโรคไม่ได้ผล การแทรกแซงตั้งแต่เนิ่นๆ ขึ้นอยู่กับการระบุการติดเชื้อก่อนเริ่มแสดงอาการ-หรือแม้แต่การตรวจจับการมีอยู่ของไวรัสในแมลงพาหะก่อนที่จะแพร่ไวรัสไปยังพืช แม้ว่าความก้าวหน้าล่าสุดในการขยายสัญญาณอุณหภูมิคงที่และการวินิจฉัยโดยใช้ CRISPR- จะนำเสนอวิธีแก้ปัญหาที่เป็นไปได้ แต่การใช้งานจริงต้องเผชิญกับข้อจำกัดโดยธรรมชาติ ได้แก่ ความไม่เข้ากันระหว่างการขยายสัญญาณด้วยเอนไซม์และระบบ CRISPR ความเสี่ยงในการปนเปื้อนจากขั้นตอนหลายขั้นตอน และความสามารถในการปรับตัวภาคสนามที่ไม่เพียงพอของอุปกรณ์ตรวจจับ เพื่อจัดการกับความท้าทายเหล่านี้ เราได้พัฒนา MaC14a-แพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกที่ได้รับการปรับปรุงด้วย AI- ซึ่งผสานรวมการขยายอย่างรวดเร็วโดยไอโซเทอร์มัลของเอนไซม์หลายตัวที่ไม่สมมาตร (aMIRA) เข้ากับ CRISPR-Cas14a ระบบนี้เอาชนะอุปสรรคทางเทคนิคที่สำคัญโดยการปรับปริมาณสารสัมพันธ์ของไพรเมอร์ให้เหมาะสมเพื่อสร้าง ssDNA สำหรับการเปิดใช้งาน Cas14a อิสระของ PAM{12}} ทำให้ได้รับการตรวจจับที่มีความไวสูงเป็นพิเศษ (10 fM) ในขณะเดียวกันก็กำจัด-การปนเปื้อนข้ามผ่านปฏิกิริยา-หลอดเดียว เมื่อใช้ร่วมกับชิปไมโครฟลูอิดิกแบบแรงเหวี่ยง การตรวจจับด้วยแสงแบบพกพา และการตีความสัญญาณด้วยการเรียนรู้ของเครื่อง- MaC14a ช่วยให้การตรวจจับแบบมัลติเพล็กซ์ของไวรัส gemini 4 ตัวได้ภายใน 5 นาที แสดงให้เห็นถึงความแม่นยำในการวินิจฉัย 100 % สำหรับตัวอย่างทั้งพืชและแมลงหวี่ขาว ความก้าวหน้าประกอบด้วย: (i) การตรวจหาการติดเชื้อก่อนแสดงอาการในพืช และ (ii) การระบุการขนส่งไวรัสในแมลงหวี่ขาวแต่ละตัวอย่างแม่นยำ- ซึ่งเติมเต็มช่องว่างทางเทคโนโลยีที่สำคัญในการเฝ้าระวัง-ก่อนการแพร่เชื้อ นอกเหนือจากการจัดหาเครื่องมือใหม่สำหรับการจัดการไวรัสเจมิไนแล้ว การศึกษานี้ยังได้สร้างกระบวนทัศน์ "AI-CRISPR-ไมโครฟลูอิดิกส์" สำหรับการอารักขาพืชผล ด้วยการเปลี่ยนการมุ่งเน้นจากพืชที่มีอาการไปเป็นพาหะนำเชื้อไวรัสและการติดเชื้อที่ไม่แสดงอาการ เทคโนโลยีนี้นำเสนอโซลูชั่นที่เปลี่ยนแปลงเพื่อขัดขวางวงจรการแพร่เชื้อไวรัสที่แหล่งที่มา
เวิร์กโฟลว์แบบรวมของระบบ MaC14a สำหรับการเฝ้าระวังไวรัส geminivirus แบบมัลติเพล็กซ์
(A) กลไกของการตรวจหากรดนิวคลีอิกที่เป็นสื่อกลางของ aMIRA-Cas14a- แผนผังที่แสดงให้เห็น-การขยาย ssDNA ที่ขับเคลื่อนด้วย MIRA ควบคู่ไปกับการจดจำ ssDNA อิสระของ PAM ของ Cas14a และกิจกรรมการแยกส่วนหลักประกัน ทำให้สามารถตรวจจับ-หลอดเดียว (เข้ากันได้กับเครื่องมือ PCR ฟลูออเรสเซนต์แบบเรียลไทม์-) หรือการวิเคราะห์ไมโครฟลูอิดิกบน-ไซต์ (ผ่านอุปกรณ์ตรวจจับแบบแรงเหวี่ยง{9}}ที่พัฒนาขึ้นเอง) (B) ขั้นตอนการทำงานการตรวจจับไมโครฟลูอิดิก (MaC14a) สำหรับการวินิจฉัย-ที่ปรับใช้ได้ภาคสนาม ขั้นตอนของเวลาจะระบุด้วยลูกศร ซึ่งแสดงระยะเวลาของแต่ละกระบวนการภายในเครื่องวิเคราะห์แบบพกพา (C) ผังงานของอัลกอริธึมการตรวจจับแบบเรียลไทม์-โดยอิงตามเครือข่ายหน่วยความจำระยะสั้นแบบยาว (LSTM) อัลกอริธึมที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมช่วยให้การประมวลผลสัญญาณฟลูออเรสเซนซ์-แบบเรียลไทม์ ช่วยให้สามารถตีความผลลัพธ์ได้ภายใน 5–10 นาที
ระบบตรวจจับ aMIRA-Cas14a
(A) แผนภาพแสดงกลไกการเกิดปฏิกิริยาของแท่นตรวจจับ aMIRA-Cas14a (B) กิจกรรมการแยกเฉพาะของ Cas14a บนผลิตภัณฑ์ aMIRA ได้รับการตรวจสอบผ่านการวิเคราะห์เจลอิเล็กโตรโฟเรซิส (C) การวิเคราะห์เปรียบเทียบของวิธีการตรวจจับ aMIRA หนึ่ง-ขั้นตอนและสอง-ขั้นตอน-Cas14a หมายเหตุ: ในโปรโตคอลปฏิกิริยาสอง-ขั้นตอน กระบวนการเริ่มต้นด้วยการขยาย aMIR เป็นเวลา 20- นาที ตามด้วยการเพิ่มระบบการตรวจจับ Cas14a สำหรับการตรวจติดตามเรืองแสง ด้วยเหตุนี้ การรวบรวมสัญญาณเรืองแสงจึงเริ่มต้นที่จุดเวลา 20 นาที (D) และ (E) การทดลองหาค่าเหมาะที่สุดได้ดำเนินการเพื่อหาอัตราส่วนไพรเมอร์ไปข้างหน้าและย้อนกลับที่เหมาะสมที่สุด (F – I) ความจำเพาะของระบบ aMIRA-Cas14a ได้รับการตรวจสอบผ่านการตรวจหาเป้าหมายไวรัสที่แตกต่างกันสี่เป้าหมาย (TYLCCNV, TYLCV, TOLCNDV และ TbCSV) ในตัวอย่างพืช ตัวอย่างผสม (กำหนดเป็นมิกซ์) เตรียมโดยการรวมปริมาตรที่เท่ากันของการเตรียม DNA ของไวรัสแต่ละรายการ
เพื่อให้บรรลุการขยายสัญญาณสำหรับกรดนิวคลีอิกของไวรัสในปริมาณเล็กน้อย และจัดให้มีซับสเตรตที่เพียงพอสำหรับ Cas14a เราได้พัฒนา aMIRA (การขยายอย่างรวดเร็วโดยไอโซเทอร์มอลของเอนไซม์หลายตัวแบบไม่สมมาตร) โดยใช้ MIRA ผลลัพธ์ของระบบ aMIRA-Cas14a มีข้อดีที่สำคัญดังต่อไปนี้:
1. ปริมาณสารสัมพันธ์ของไพรเมอร์ที่ได้รับการปรับปรุงให้เหมาะสมช่วยให้ MIRA สามารถสร้าง ssDNA มากเกินไปเป็นพิเศษ ซึ่งทำหน้าที่เป็นสารตั้งต้นโดยตรงสำหรับ Cas14a ด้วยการปรับอัตราส่วนไพรเมอร์ไปข้างหน้า-เป็น-ย้อนกลับเป็น 20:1 ระบบจะสร้าง ssDNA ที่เพียงพอเพื่อเปิดใช้งานกิจกรรมการแยกส่วนอิสระของ PAM- ของ Cas14a ซึ่งจดจำและแยก ssDNA โดยเฉพาะ
2. การผสานรวม MIRA และ CRISPR-Cas14a ในหม้อเดียวช่วยลดความเสี่ยงในการปนเปื้อนข้าม
3. MIRA ช่วยเพิ่มความไวในการตรวจจับได้อย่างมาก ทำให้สามารถตรวจจับกรดนิวคลีอิกของไวรัสที่มีปริมาณน้อยมากเป็นพิเศษ
4. aMIRA-Cas14a รักษาความจำเพาะสูง หลีกเลี่ยงผลบวกลวงที่เกิดจากการขยายเสียงที่ไม่เฉพาะเจาะจง
ท้ายที่สุดแล้ว การบูรณาการ MIRA และ CRISPR-Cas14a ในหม้อเดียวช่วยลดความเสี่ยงในการปนเปื้อนและบรรลุการทำงานร่วมกันที่สมบูรณ์แบบระหว่างจุดแข็งของ MIRA และระบบ CRISPR-Cas14a ซึ่งช่วยแก้ไขความท้าทายทั่วทั้งอุตสาหกรรมในเรื่องความไม่เข้ากันระหว่างการขยายอุณหภูมิคงที่และระบบ CRISPR ซึ่งแสดงถึงความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีหลักของแพลตฟอร์ม MaC14a ระบบ aMIRA-Cas14a ได้รับการปรับปรุงความไวถึง 1,000 เท่าพร้อมทั้งรับประกันการขยายสัญญาณเฉพาะ เมื่อรวมกับการจดจำลำดับเฉพาะของ Cas14a แล้ว จะให้การตรวจสอบความจำเพาะแบบสองชั้น โดยไม่มีปฏิกิริยาข้ามกับไวรัสที่ไม่ใช่เป้าหมายหรือตัวอย่างที่ดีต่อสุขภาพ- ซึ่งช่วยจัดการกับปัญหาอีกประการหนึ่งของอุตสาหกรรม นั่นคือ แนวโน้มผลบวกลวง
รีเอเจนต์การขยายความร้อนอย่างรวดเร็วของหลายเอนไซม์ MIRA ที่ใช้ในการศึกษานี้จัดทำโดย Amp‑Future (Changzhou) Biotech Co., Ltd. นอกเหนือจากประสิทธิภาพของรีเอเจนต์ที่ยอดเยี่ยมแล้ว Amp‑future Biotech ยังมีทีมสนับสนุนทางเทคนิคมืออาชีพที่ตอบสนองอย่างรวดเร็วอีกด้วย
MIRA แสดงให้เห็นถึงความเข้ากันได้อย่างมากกับชิปไมโครฟลูอิดิกที่ใช้เครื่องหมุนเหวี่ยง-ซึ่งพัฒนาขึ้นสำหรับการใช้งานด้านการวิจัยและการวินิจฉัย:
1.ระบบปฏิกิริยาขนาดเล็ก เหมาะสำหรับห้องปฏิกิริยาขนาดเล็ก- ซึ่งเป็นคุณลักษณะเฉพาะของชิปไมโครฟลูอิดิก
2. ความสามารถในการตรวจจับมัลติเพล็กซ์ในการทำงานครั้งเดียว
3. ความเข้ากันได้กับอุปกรณ์พกพา ขั้นตอนการทำงานที่ราบรื่นตั้งแต่ตัวอย่างไปจนถึงผลลัพธ์
เครื่องวิเคราะห์แบบพกพาและสถาปัตยกรรมชิป
(A) มุมมองแบบระเบิดของอุปกรณ์ตรวจจับแบบพกพา ซึ่งแสดงส่วนประกอบหลัก (B) สถาปัตยกรรมโมดูลาร์ของชิปไมโครฟลูอิดิกแบบแรงเหวี่ยง (C) การควบคุมของไหลที่ขับเคลื่อนด้วยการหมุนเหวี่ยง การวิเคราะห์วิถีการเคลื่อนที่ของของเหลวภายใต้แรงเหวี่ยงที่ตั้งโปรแกรมได้
เราออกแบบอุปกรณ์พกพา "ตัวอย่าง-เข้า รับสาย-" จุด-ของ-การทดสอบการดูแล (POCT) ที่ปรับให้เหมาะสมสำหรับการใช้งานภาคสนาม ดังที่แสดงในรูปที่. 4A เครื่องต้นแบบขนาดกะทัดรัด (23 ซม. (ย) × 21 ซม. (กว้าง) × 14 ซม. (สูง) มวลรวม 12.5 กก.) ให้ความสะดวกในการพกพาเป็นพิเศษ ส่วนประกอบหลักของระบบประกอบด้วยเซอร์โวมอเตอร์-ที่มีความแม่นยำสูงสำหรับการควบคุมการหมุนที่แม่นยำและหน่วยทำความร้อนด้วยอากาศสำหรับการควบคุมอุณหภูมิ โมดูลการตรวจจับด้วยแสงในตัวซึ่งวางอยู่ใต้ชิป ช่วยอำนวยความสะดวกในการกระตุ้นและการวัดแสงฟลูออเรสเซนต์ ทำให้มั่นใจได้ถึงความไวและความแม่นยำในการตรวจจับสูง อุปกรณ์พกพาดังกล่าวมาพร้อมกับระบบปฏิบัติการ Android แบบฝัง ซึ่งมีอินเทอร์เฟซ-ที่เป็นมิตรต่อผู้ใช้ ซึ่งผู้ปฏิบัติงานสามารถเลือกไฟล์การทำงานที่ตั้งโปรแกรมไว้ล่วงหน้าซึ่งมีพารามิเตอร์โดยละเอียด เช่น เวลาตอบสนองและอุณหภูมิ ผลลัพธ์และข้อสรุปจะแสดงแบบเรียลไทม์-บนหน้าจอ LCD ช่วยให้สามารถรับข้อมูลได้อย่างรวดเร็ว นอกจากนี้ ระบบยังรวมโมดูลการสื่อสารไร้สายที่รองรับ-การส่งข้อมูลแบบเรียลไทม์ไปยังอุปกรณ์เคลื่อนที่หรือเซิร์ฟเวอร์คลาวด์ ผสานรวมกับอัลกอริธึมปัญญาประดิษฐ์เพื่อการตีความและการวิเคราะห์ผลการทดสอบในทันที
เพื่อประเมินความสามารถของระบบ MaC14a ในการตรวจจับการแพร่กระจายของไวรัสในแมลงพาหะ เราได้ดำเนินการตรวจวิเคราะห์การได้มาของ TYLCV โดยใช้
ประชากรเบมิเซีย ทาบาซี แมลงหวี่ขาวได้รับอนุญาตให้กินอาหารได้ 3- วันสำหรับพืชที่ติดเชื้อ TYLCV จากนั้นจึงดำเนินการผ่าน
ระบบ MaC14a (รูปที่ D) การวิเคราะห์ในเวลาต่อมาเผยให้เห็นว่าแมลงหวี่ขาวที่ทดสอบ 8 ใน 10 ตัว (80%) แสดงสัญญาณไวรัสเชิงบวก (รูปที่ E) ที่สำคัญ ตัวอย่างทั้งหมดจากกลุ่มควบคุมเชิงลบ (ที่เลี้ยงด้วยพืชที่มีสุขภาพดีโดยเฉพาะ) ยังคงรักษาระดับการเรืองแสงที่เป็นพื้นฐานไว้ ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าระบบ MaC14a สามารถระบุ-ไวรัสที่เป็นพาหะของแมลงหวี่ขาวในแต่ละระดับได้อย่างแม่นยำ โดยเน้นย้ำถึงศักยภาพของมันในการติดตามและควบคุมการแพร่กระจายของไวรัสในพื้นที่เกษตรกรรม
ในการทดลอง-การตรวจสอบแบบปกปิดสองทางครั้งต่อมา เราได้ทดสอบตัวอย่างใบมะเขือเทศ (S1–S20) จำนวน 20 ตัวอย่างที่รวบรวมจากเขตเพาะปลูกเรือนกระจกสองแห่งในหางโจว มณฑลเจ้อเจียง ประเทศจีน และเรือนกระจกสองแห่งเขตเพาะปลูกในเมืองหนานหนิง มณฑลกว่างซี ประเทศจีน แต่ละโซนให้ตัวอย่างใบมะเขือเทศจำนวน 5 ตัวอย่างที่แสดงอาการโดยทั่วไปของไวรัสการติดเชื้อ (เช่น คลอโรซีส รอยจุดโมเสก และการม้วนงอของใบ) และห้าแมลงหวี่ขาว (ทั้งหมด 20 ตัว) ระบบ MaC14a ที่ปรับปรุงด้วย AI- ได้ถูกส่งมอบอีกครั้งsults ในนาทีที่ 5 ซึ่งสอดคล้องกับที่ได้รับอย่างสมบูรณ์จากการทดสอบ aMIRA-Cas14a และแพลตฟอร์ม qPCR 60- นาที ซึ่งแสดงให้เห็นข้อตกลง 100 % (รูป F, S6-S7, ตาราง S3) นอกจากนี้ไวรัสชนิดที่ตรวจพบในตัวอย่างพืชมีความสอดคล้องกับชนิดพันธุ์เหล่านั้นสูงระบุอยู่ในแมลงพาหะจากเขตเพาะปลูกเดียวกัน เหล่านี้ผลลัพธ์เน้นถึงศักยภาพที่สำคัญของ-MaC14a ที่ปรับปรุงโดย AI ใน-การวินิจฉัยไวรัสพืชไซต์ บรรลุความเร็วสูง (จากกรดนิวคลีอิกการสกัดเพื่ออ่านผลลัพธ์ในเวลาเพียง 10 นาที) ความแม่นยำสูง (สม่ำเสมอด้วยผลลัพธ์ qPCR) และความสะดวกในการพกพา
