การควบคุมกิจกรรม Cas12 แบบปรับได้ช่วยส่งเสริมการตรวจจับกรดนิวคลีอิกในหม้อ-ที่เป็นสากลและรวดเร็ว
จัดพิมพ์โดย: มหาวิทยาลัยวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศจีน
วารสาร: การสื่อสารธรรมชาติ
ปัจจัยผลกระทบ: 14.7
ด้วยการใช้เทคโนโลยี MIRA จึงได้พัฒนาวิธีการตรวจจับกรดนิวคลีอิกเรืองแสง (SURVEY) แบบหม้อเดียวแบบสากล-ที่ใช้โซเดียมเฮปาริน การศึกษาแสดงให้เห็นว่าโซเดียมเฮปารินสามารถควบคุมการออกฤทธิ์ของการตัดแยก Cas12a ได้โดยการแทรกแซงกระบวนการจับ Cas12a-crRNA ด้วยการปรับความเข้มข้นของโซเดียมเฮปาริน การสำรวจจึงเข้ากันได้กับลำดับ PAM ทั้งแบบคลาสสิกและต่ำกว่าปกติ และใช้ได้กับชนิดย่อย Cas12 หลายชนิด วิธีนี้ใช้เวลาตรวจจับเพียง 15-20 นาที ทำให้ได้ความไวและความจำเพาะเกิน 95% สำหรับการตรวจหาไวรัสหลอกโรคฝีลิง ไวรัสไข้หวัดใหญ่ A และโรคซาร์ส-CoV-2 ต้นทุนต่ำ-และมอบวิธีการตรวจจับ ณ จุดดูแลแบบใหม่สำหรับการวินิจฉัยทางการแพทย์และการตรวจสอบสภาพแวดล้อม จัดการกับความสมดุลที่ยากลำบากระหว่างความไวและความจำเพาะในการวินิจฉัย CRISPR แบบดั้งเดิม
1. ศึกษากลไกการออกฤทธิ์ของเฮปารินโซเดียม
มีการเพิ่มโพรบฟลูออเรสเซนต์ลงในระบบ Cas12a-crRNA ที่มี DNA เป้าหมาย 10 นาโนโมลาร์ และตรวจพบสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ที่รวดเร็วและมีนัยสำคัญโดยไม่ต้องเติมโซเดียมเฮปาริน เมื่อเติมโซเดียมเฮปาริน 0.2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร สัญญาณฟลูออเรสเซนต์จะคล้ายคลึงกับสัญญาณของกลุ่มควบคุม ซึ่งบ่งชี้ว่าโซเดียมเฮปารินยับยั้งกิจกรรมการตัดแยกทรานส์-ของ Cas12a. 0.2ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของโซเดียมเฮปารินเป็นความเข้มข้นต่ำสุดในการยับยั้งอย่างมาก เมื่อความเข้มข้นของโซเดียมเฮปารินเพิ่มขึ้นจาก 0.2 มก./มล. เป็น 0.5 มก./มล. กิจกรรมของความแตกแยกซิส-ของ Cas12a จะถูกค่อยๆ ยับยั้ง และที่ 0.5 มก./มล. กิจกรรมของความแตกแยกของทรานส์-จะถูกยับยั้งเกือบทั้งหมด การศึกษากลไกการออกฤทธิ์ของโซเดียมเฮปารินแสดงให้เห็นว่ากลุ่มโซเดียมเฮปารินที่มีประจุลบรบกวนการจับกันที่ถูกต้องของ crRNA กับ Cas12a และอาจส่งผลต่อการก่อตัวของ crRNACas12a binary complex
- MIRA-Cas12a one-การตรวจจับหม้อ
หลังจากตรวจสอบกลไกการออกฤทธิ์ของโซเดียมเฮปารินแล้ว งานวิจัยนี้ได้สำรวจ-กลยุทธ์การตรวจจับแบบหม้อเดียว (MIRA-Cas12a) ซึ่งรวมการขยายของ MIRA และการตรวจจับเรืองแสงแบบพึ่งสื่อกลาง Cas12a- ในหลอดเดียว
ในกรณีที่ไม่มีโซเดียมเฮปาริน การใช้ MIRA-Cas12a ร่วมกันไม่สร้างสัญญาณเรืองแสงที่มีนัยสำคัญภายในช่วงความเข้มข้นของยีนเป้าหมายที่ 0.1aM ถึง 10fM ที่โซเดียมเฮปาริน 40 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร สัญญาณเรืองแสงที่มีนัยสำคัญถูกสังเกตพบตลอดช่วงความเข้มข้นเป้าหมายที่ 1aM (ประมาณ 0.6 ชุด/μL, ปริมาตร=30μL) ถึง 10fM (ประมาณ 6,000 ชุด/μL, ปริมาตร=30μL) ซึ่งแสดงให้เห็นการปรับปรุงความไวในการตรวจจับมากกว่า 10,000 เท่าเมื่อเปรียบเทียบกับระบบที่ไม่มีโซเดียม เฮปาริน
ความเข้มข้นของเทมเพลตไวรัส Monkeypox คือ 10 fM และใช้ Cas12a-crRNA (100 nM) เพื่อตรวจจับยีนเป้าหมาย f31 และ b6r ปฏิกิริยาการขยายสัญญาณสิ้นสุดลงที่ 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 และ 20 นาที และปริมาณผลิตภัณฑ์ขยายสัญญาณ MIRA ในเวลาต่างกันได้รับการวิเคราะห์บนเจลอะกาโรส จากนั้นผลิตภัณฑ์ที่ได้จะถูกวิเคราะห์บนเจลอะกาโรสภายใต้การตั้งค่าที่แตกต่างกันสามแบบ: MIRA-เฮปารินโซเดียมที่ไม่มี Cas12a, MIRA-Cas12a ที่ไม่มีเฮปารินโซเดียม และ MIRA-Cas12a ที่มีเฮปารินโซเดียม ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าในกรณีที่ไม่มีเฮปารินโซเดียม การขยายกรดนิวคลีอิกถูกขัดขวางเนื่องจากกิจกรรมการตัดแยกที่มีซิส-สูงของ Cas12a อย่างไรก็ตาม การเติมเฮปารินโซเดียมช่วยเพิ่มการขยายตัวของกรดนิวคลีอิกอย่างมีนัยสำคัญ เนื่องจากการลดการทำงานของความแตกแยก cis{27}} ของ Cas12a
บทความนี้แสดงให้เห็นว่าวิธีการตรวจจับกรดนิวคลีอิกเรืองแสง (SURVEY) แบบหม้อเดียวแบบสากล-ที่ใช้โซเดียมเฮปารินสามารถทำได้โดยใช้ทั้งลำดับ PAM แบบคลาสสิกและลำดับ PAM ที่ต่ำกว่าปกติ นอกจากนี้ นอกจาก LbCas12a แล้ว AsCas12a และ AapCas12b ยังใช้กันอย่างแพร่หลายในวิธี CRISPR-Dx อีกด้วย ในระบบที่ใช้ MIRA-AsCas12a จะตรวจพบการเรืองแสงเมื่อมีโซเดียมเฮปาริน 40 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรเท่านั้น ซึ่งบ่งชี้ว่าสามารถตรวจจับยีน f31 และ b6r ได้ 1fM ในกรณีที่ไม่มีโซเดียมเฮปาริน MIRA-AapCas12b สามารถตรวจพบยีน f31 และ b6r ได้ 1 ตัว การให้โซเดียมเฮปารินขนาด 20 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรไม่เพียงช่วยเร่งอัตราการตรวจพบ MIRA-AapCas12b เท่านั้น แต่ยังเพิ่มความเข้มของแสงเรืองแสงอีกด้วย การค้นพบเหล่านี้บ่งชี้ว่าวิธี-พ็อตเดียวที่พัฒนาโดยใช้ขนาดยาโซเดียมเฮปารินสามารถใช้ได้กับชนิดย่อย Cas12 อื่นๆ เช่นกัน
