《 การจัดตั้ง micropterus salmoides rhabdovirus วิธีการตรวจจับตามระบบ CRISPR CAS13A Express
Zhang Minlin, Huang Fengqi, Zuo Xiaoling, Liang Jiantao, Liang Kaishan, Dan Jinhong, Li Zongyang, Yu Jie, Luo Liyuan, Xie Zijie, Zhao Huihong, Wang Qing วารสาร Hydrobiology ของจีน, 2024, 48 (2): 283-291 ดอย: 10.7541/2023.2023.0199
Micropterus salmoides หรือที่รู้จักกันในชื่อ California Bass หรือ American Black Bass เป็นปลาน้ำจืดที่มีถิ่นกำเนิดในอเมริกาเหนือ ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมามันได้กลายเป็นปลาฟาร์มที่สำคัญทั่วโลกเนื่องจากความต้องการของตลาดสูง: Micropterus salmoides มีเนื้อสัตว์ที่มั่นคงกระดูกไม่กี่รสชาติอร่อยโภชนาการที่อุดมสมบูรณ์โดยเฉพาะอย่างยิ่งโปรตีนสูงและไขมันต่ำซึ่งเป็นไปตามความต้องการของผู้บริโภคสำหรับอาหารเพื่อสุขภาพ ดังนั้นราคาตลาดจึงค่อนข้างสูงและมักจะใช้ในตลาดจัดเลี้ยงระดับสูง การเติบโตอย่างรวดเร็ว: micropterus salmoides เติบโตอย่างรวดเร็วและโดยทั่วไปสามารถเข้าถึงข้อกำหนดของสินค้าโภคภัณฑ์ใน 6-8 เดือน เหมาะสำหรับการผสมพันธุ์ระยะสั้นและสามารถรับผลตอบแทนการลงทุนได้อย่างรวดเร็ว ความต้านทานโรคที่รุนแรง: เมื่อเทียบกับปลาที่ทำไร่ไถนาอื่น ๆ Micropterus salmoides มีความสามารถในการปรับตัวที่แข็งแกร่งกับสิ่งแวดล้อมการระบาดของโรคขนาดใหญ่น้อยลงและลดความเสี่ยงในการผสมพันธุ์ การผสมพันธุ์ทางนิเวศวิทยา: เบส Largemouth สามารถผสมกับปลาน้ำจืดอื่น ๆ เช่นปลาคาร์พเงินและปลาคาร์พหญ้าซึ่งช่วยให้เกิดความสมดุลทางนิเวศวิทยาของบ่อและเพิ่มการใช้ทรัพยากรสูงสุดปรับปรุงประสิทธิภาพการผสมพันธุ์และปัจจัยอื่น ๆ ได้รับการต้อนรับจากนักทานและเกษตรกรเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำและระดับการเพาะพันธุ์เติบโตอย่างรวดเร็วในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา
แม้ว่า micropterus salmoides นั้นค่อนข้างดื้อรั้น แต่พวกเขาอาจยังคงเป็นโรคบางชนิดภายใต้สภาวะการผสมพันธุ์ที่ไม่ดี ในหมู่พวกเขา Micropterus salmoides rhabdovirus (MSRV) เป็นอันตรายอย่างยิ่ง: มันถูกค้นพบครั้งแรกในฟลอริดาสหรัฐอเมริกาในปี 1991 ไวรัสถูกตรวจพบในครั้งแรกในประชากรเบส Largemouth ป่าและค่อยๆแพร่กระจายไปยังทะเลสาบน้ำจืดหลายแห่ง
อาการทางคลินิกของปลาที่เป็นโรค
ตอบ: เบสลาร์จมั ธ ที่มีสุขภาพดีลูกศรบ่งบอกถึงถุงไข่แดง B: เบส largemouth ที่เป็นโรคลูกศรบ่งบอกถึงถุงไข่แดง
แหล่งที่มาของการส่งผ่านมักจะติดเชื้อหรือปลาสำหรับผู้ใหญ่แหล่งน้ำที่ปนเปื้อนและปลาป่าที่มีไวรัส ไวรัสนี้สามารถส่งผ่านการสัมผัสโดยตรงการขับถ่ายอุจจาระและแหล่งน้ำและมีแนวโน้มที่จะเกิดขึ้นภายใต้คุณภาพน้ำที่ไม่ดีหรือสภาพการผสมพันธุ์ที่มีความหนาแน่นสูง การแพร่กระจาย ไวรัสสามารถทำให้ง่วง, หลงทาง, บวมในช่องท้องและการบิดเบือนร่างกายในปลาเด็กและเยาวชนเช่นเดียวกับการชักนำให้เกิดแผลในกระเพาะอาหารและเลือดออกหลายอวัยวะ เมื่อติดเชื้อแล้วอัตราการตายสูงกว่า 90%
อาการทางคลินิกของ micropterus salmoides ที่ติดเชื้อเทียม
ตอบ: เบสลาร์จมั ธ ที่มีสุขภาพดี; B, C, D: เบส Largemouth ที่ติดเชื้อเทียม
ทุกปีมากกว่า 30% ของ micropterus salmoides ทอดจะหายไปเนื่องจาก MSRV ปัจจุบันวิธีการรักษาและการตรวจจับสำหรับไวรัสยังไม่บรรลุนิติภาวะและไม่มียาเฉพาะที่จะรักษา ดังนั้นจึงจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องตรวจจับไวรัสในเวลาก่อนการติดเชื้อและใช้มาตรการป้องกันที่มีประสิทธิภาพซึ่งสามารถลดการสูญเสียในกระบวนการผสมพันธุ์ในระดับหนึ่ง
นอกจากนี้มันเป็นเรื่องยากที่จะทำการตรวจจับในสถานที่โดยไม่มีอุปกรณ์ตรวจจับที่ซับซ้อนด้วยเทคโนโลยีการตรวจจับที่มีอยู่ ในการเผชิญกับความท้าทายนี้ทีมวิจัยของ South China Agricultural University ได้พัฒนาวิธีการตรวจจับแบบใหม่ที่รวม Mira เข้ากับระบบ CRISPR วิธีนี้มีความจำเพาะที่แข็งแกร่งความไวสูงและการทำงานที่ง่ายซึ่งช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพการตรวจจับของ MSRV อย่างมากและยังช่วยตรวจจับ MSRV ให้เร็วที่สุดและใช้มาตรการป้องกันและควบคุม
การคัดกรองการรวมกันของ Mira Primer
ไพรเมอร์ Mira สองคู่ที่แตกต่างกันถูกนำมาใช้เพื่อขยายส่วนของยีนที่มีลำดับเป้าหมายและผลิตภัณฑ์ที่ขยายออกไปจะถูกอิเล็กโทรโฟเรซิสเจล agarose กราฟอิเล็กโทรโฟเรซิสตั้งอยู่ที่ตำแหน่ง 100 bp และแถบสว่างปรากฏขึ้นในเลนทั้งสามแสดงว่ามีผลิตภัณฑ์ขยายที่ไม่เฉพาะเจาะจง แถบเป้าหมายที่ขยายตัวที่ 250 bp ในเลน 2 และ 3 ได้รับการวิเคราะห์เชิงปริมาณตามลำดับโดยซอฟต์แวร์ Image J และผลลัพธ์ของการวิเคราะห์เชิงปริมาณถูกแสดงโดย "ค่าสีเทา" จากผลการวิเคราะห์สามารถสรุปได้ว่ายิ่งค่าสีเทาลดลงเท่าใดอัตราการใช้งานของไพรเมอร์ก็ยิ่งสูงขึ้นนั่นก็คือยิ่งประสิทธิภาพการขยายตัวของไพรเมอร์มีผลผูกพันเฉพาะ
ผลการวิจัยพบว่าประสิทธิภาพการขยายการเชื่อมโยงที่เฉพาะเจาะจงนั้นสูงเมื่อใช้คู่ไพรเมอร์ MIRA-F2/R2
Mira Primer คู่คัดกรองภาพเจลอิเล็กโทรโฟเรซิสและการวิเคราะห์ค่าสีเทา
. Electrophoresis Lane M: 2000 BP DNA marker; Electrophoresis Lane 1. การขยายตัวอย่างดีเอ็นเอเชิงลบ; Electrophoresis Lane 2. MiRA-F1/R1 Primer Pair จะขยายส่วนเป้าหมาย (224 bp ดังแสดงในกล่อง); Electrophoresis Lane 3. MiRA-F2/R2 Primer คู่ขยายส่วนเป้าหมาย (255 bp ดังแสดงในกล่อง); ข. การวิเคราะห์ค่าสีเทา (ดังแสดงในกล่อง)
ระบบตรวจจับ CRISPR/CAS13A
หลังจากปฏิกิริยาของระบบตรวจจับ CRISPR/CAS13A เสร็จสมบูรณ์แล้วมันจะถูกฉายรังสีด้วยแสงอัลตราไวโอเลตเพื่อสังเกตผลลัพธ์
CRISPR/CAS13A ระบบตรวจจับความสว่างของฟลูออเรสเซนต์
1-3 ระบบทั้งหมดที่มีมาตรฐาน RNA เพิ่ม; 4. ไม่มีการเพิ่ม crRNA; 5. ไม่มีการเพิ่มโปรตีน Cas13a; 6. ไม่มีการเพิ่มโพรบนักข่าว ssRNA; 7. การควบคุมเชิงลบ
ระบบปฏิกิริยาที่ดีที่สุดของ CRISPR/CAS13A-MSRV
เราทำการทดลองโดยใช้มาตรฐาน RNA และเพิ่มตัวอย่าง RNA ความเร็วในการวางตำแหน่งของ RNA เป้าหมายดีกว่าด้วย CRRNA2 มากกว่า CRRNA1 CRRNA1 มีสัญญาณเรืองแสงขั้นสุดท้ายที่แข็งแกร่งกว่า CRRNA2 การใช้แบบผสมของ crRNA 1+ crRNA2 ในสัดส่วนที่เท่ากันสามารถรวมข้อดีของทั้งสองและบรรลุประสิทธิภาพการเกิดปฏิกิริยาที่ดีขึ้น
การเพิ่มประสิทธิภาพของ CRISPR/CAS13A-MSRV เงื่อนไขการตรวจจับและผลการตรวจจับ
. การเปรียบเทียบผลการตรวจจับของ RNA มาตรฐานโดยใช้ crRNA กับลำดับตัวเว้นวรรคที่แตกต่างกัน
ข. การเปรียบเทียบข้อมูลสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ของ RNA มาตรฐานที่ตรวจพบโดยระบบตรวจจับที่อุณหภูมิต่างกัน
ค. การเปรียบเทียบข้อมูลสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ของ RNA มาตรฐานที่ตรวจพบโดยใช้โพรบ RNA Reporter ที่มีความเข้มข้นต่างกัน
d. การเปรียบเทียบผลการตรวจจับของ RNA มาตรฐานที่ตรวจพบโดยใช้คอมเพล็กซ์โพรบ Cas13a/crRNA ที่มีอัตราส่วนความเข้มข้นที่แตกต่างกัน
ในการสำรวจผลกระทบของอุณหภูมิปฏิกิริยาต่อระบบตรวจจับอุณหภูมิปฏิกิริยาที่แตกต่างกันของ 31 องศา, 34 องศา, 37 องศาและ 41 องศาถูกตั้งค่า อุณหภูมิปฏิกิริยาที่ดีที่สุดของระบบตรวจจับ CRISPR/CAS13A-MSRV คือ 37 องศา
ในการสำรวจผลกระทบของความเข้มข้นของนักข่าว ssRNA ในระบบตรวจจับภายในช่วงการทดสอบความเข้มของการเรืองแสงมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับความเข้มข้นของโพรบนักข่าว ssRNA ผลการตรวจจับของความเข้มข้นของโพรบนักข่าว ssRNA ไม่แตกต่างกันมากที่ 500-700 nmol/l เมื่อพิจารณาถึงปัญหาทางเศรษฐกิจที่แท้จริงความเข้มข้นของนักข่าว SSRNA ที่ดีที่สุดคือ 500 nmol/L
ในการสำรวจผลกระทบของอัตราส่วนความเข้มข้นของปฏิกิริยา CAS13A และ crRNA ที่แตกต่างกันในระบบตรวจจับเมื่ออัตราส่วนของ CAS13A: crRNA คือ 4: 1 และ 3: 1 ขึ้นอยู่กับอัตราส่วน 100 nmol/L ต่อส่วน CAS13A มาถึงความอิ่มตัว; เมื่อปริมาณของ Cas13a คงที่ความเข้มของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ไม่ได้มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับการเพิ่มขึ้นของปริมาณ crRNA ดังนั้นเมื่ออัตราส่วนของ CAS13A ต่อ crRNA คือ 2: 1 ระบบตรวจจับ CRISPR/CAS13A-MSRV สามารถบรรลุกิจกรรมการตรวจจับได้สูงสุด
การประเมินความไว
เพื่อสำรวจความเข้มข้นของการตรวจจับขั้นต่ำของ MSRV โดยระบบตรวจจับ CRISPR/CAS13A-MSRV มาตรฐาน RNA จะถูกเจือจาง 10 ครั้งในซีรีส์และตรวจพบโดยระบบตรวจจับ CRISPR/CAS13A-MSRV ระบบตรวจจับ CRISPR/CAS13A-MSRV สามารถตรวจจับ RNA เป้าหมาย MSRV อย่างน้อย 100FM เมื่อความเข้มข้นของ RNA เป้าหมายต่ำกว่า 100FM สัญญาณฟลูออเรสเซนต์ที่ตรวจพบโดยเครื่องไม่แตกต่างจากการควบคุมเปล่าอย่างมีนัยสำคัญ ดังนั้นระบบตรวจจับ CRISPR/CAS13A-MSRV สามารถตรวจจับ MSRV SSRNA ได้อย่างน้อย 100FM
การประเมินความจำเพาะของระบบตรวจจับ CRISPR/CAS13A-MSRV สำหรับ MSRV
การทดสอบตัวอย่าง
สำหรับตัวอย่างปลาป่วยที่มีอาการชัดเจนของการเจ็บป่วยที่เก็บรวบรวมจากฟาร์มปลากะพงทะเลเราตรวจสอบว่าเชื้อโรคที่ติดเชื้อโดยปลาป่วยเป็น MSRV หรือไม่ เราใช้ไพรเมอร์เฉพาะกับลำดับโปรตีน MSRV capsid สำหรับการขยาย PCR และส่งแถบที่เกี่ยวข้องในไดอะแกรมอิเล็กโทรโฟเรซิสสำหรับการทดสอบ หลังจากเปรียบเทียบเรายืนยันว่าเป็น MSRV
การยืนยันข้อมูลลำดับ MSRV
. การขยาย PCR ของแถบผลิตภัณฑ์ 228 bp ของไพรเมอร์ MSRV; ข. ลำดับโปรตีน MSRV capsid เมื่อเทียบกับ NCBI ลำดับตัวหนาคือไซต์ที่มีผลผูกพันไซต์ต้นน้ำและปลายน้ำและพื้นที่แรเงาเป็นตำแหน่งเป้าหมายสำหรับ CRISPR/CAS13A-MSRV CRRNA1
ตัวอย่างปลาที่ติดเชื้อที่ติดเชื้อ MSRV นั้นถูกเตรียมไว้ล่วงหน้าและ preamplified สำหรับไวรัส RNA จากนั้นทดสอบกับกลุ่มควบคุมเชิงลบ ในเวลาเดียวกัน cDNA ของตัวอย่างถูกสกัดเพื่อเปรียบเทียบกับ qPCR ทั่วไป ตัวอย่างที่เป็นบวก (หมายเลข 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 และ 15) ตรวจพบโดยระบบตรวจจับ CRISPR/CAS13A-MSRV นั้นเหมือนกับผลลัพธ์ของ QPCR แบบดั้งเดิมซึ่งค่า CQ ของ QPCR อยู่ระหว่าง 18 และ 25; ในขณะที่จำนวนรอบขีด จำกัด ของตัวอย่างเชิงลบ (หมายเลข 1, 2, 4, 5, 9, 10 และ 11) มากกว่า 38 แสดงว่าตัวอย่างไม่ได้มีไวรัส MSVR โดยสรุปข้อมูลการตรวจจับของระบบตรวจจับ CRISPR/CAS13A-MSRV และ RT-qPCR ทั่วไปมีความสอดคล้องกันซึ่งบ่งชี้ว่าระบบตรวจจับ CRISPR/CAS13A-MSRV นั้นเป็นไปได้และสามารถแทนที่วิธีการตรวจจับแบบดั้งเดิมและซับซ้อนแบบดั้งเดิมในระดับหนึ่ง
แผนภูมิการเปรียบเทียบแนวตั้งของตัวอย่างข้อมูลการตรวจจับ qPCR ด้วย qPCR และ CRISPR
. การตรวจจับ qPCR ของ MSRV ตัวอย่างเกณฑ์วัฏจักรหมายเลขวัฏจักรของวัฏจักร หมายเลขวัฏจักรตัวอย่างที่ตรวจพบถูกนำมาเปรียบเทียบกับหมายเลขรอบอ้างอิงเชิงลบโดยใช้การวิเคราะห์ T-tests (** p<0.01);
ข. CAS13A รวมกับการตรวจจับ MIRA ของ MSRV ตัวอย่างคลินิกไดอะแกรมฟลูออเรสเซนต์; ค่าฟลูออเรสเซนต์ตัวอย่างที่ตรวจพบนั้นถูกนำมาเปรียบเทียบกับค่าฟลูออเรสเซนต์อ้างอิงเชิงลบโดยใช้การวิเคราะห์ T-tests (** P<0.01)
โดยสรุปวิธีการตรวจจับ CRISPR/CAS13A-MSRV ที่จัดตั้งขึ้นในการศึกษานี้ไม่จำเป็นต้องใช้เครื่องมือทดลองที่มีราคาแพงทำให้การตรวจจับในสถานที่รวดเร็วแม่นยำและสะดวก ดังนั้นหากวิธีการตรวจจับนี้ใช้ในการค้นพบ MSRV ในเวลาที่เหมาะสมในกระบวนการผสมพันธุ์จริงและใช้มาตรการที่มีเป้าหมายและมีประสิทธิภาพสามารถลดการสูญเสียที่เกิดจากโรคในกระบวนการผสมพันธุ์ได้อย่างมาก นอกจากนี้วิธีการตรวจจับนี้เร็วมีความไวสูงและเฉพาะเจาะจงและมีการใช้งานที่ยอดเยี่ยมและโอกาสในการส่งเสริมการขาย